Arbetsprincipen och beredningen av Limulus-reagenset tripeptid/endotoxinsubstrat

Limulus-reagenstripeptiden är en tripeptidsubstans med en specifik sekvens extraherad från blodcellslysat från hästskokrabba eller syntetiserad på konstgjord väg. Limulus-reagenstripeptiden är ett kromogent substrat som används för kvantitativ analys (som det bakteriella endotoxintestet) för att detektera och mäta komponenterna i gramnegativa bakterier—endotoxiner. När den påverkas av enzymer aktiverade av endotoxiner, frigörs en färgad förening (såsom p-nitroanilin), vilket gör att färgintensiteten kan mätas och korreleras med endotoxinhalten.

Arbetsprincip

Endotoxinaktivering: I närvaro av endotoxiner frisätter amebocyter i hästskokrabbblodet enzymer, vilket utlöser koagulationskaskaden.

Enzymverkan: Det aktiverade enzymet (vanligtvis koagulerande enzym) verkar sedan på ett kromogent substrat.

Kromogen reaktion: Enzymet klyver substratet och frisätter en gul förening som kallas p-nitroanilin (pNA).

Kvantitativ analys: Den gula färgens intensitet är proportionell mot endotoxinhalten i provet och mäts vanligtvis med en spektrofotometer vid en absorbans på 405 nm.

Beredningsmetoder

Limulus-reagenstripeptiden kan erhållas genom två tillvägagångssätt när det gäller beredning.

1. Extrahera naturliga komponenter från Limulus-blodceller och erhålla den aktiva tripeptiden genom separation och rening.

2. Använda fastfassyntesteknik för att sekventiellt koppla samman specifika aminosyrasekvenser, exakt kontrollera strukturen av tripeptiden.

På grund av bevarandepolicyerna för Limulus (med provinser som Zhejiang, Fujian, Guangdong och Guangxi listade det som ett "provinsiellt nyckelskyddat vattenlevande djurliv" / utfärdade Hongkong förordningar i slutet av 2012 som förbjöd bottentrålning), och eftersom utvinningsprocessen är komplex och utmanande, är kostnaden för den första metoden relativt hög. Därför används nu fastfassyntes vanligen. Genom att sekventiellt koppla specifika aminosyrasekvenser kan strukturen av tripeptiden kontrolleras exakt. Denna metod säkerställer inte bara produktens stabilitet och konsistens utan möjliggör också storskalig produktion, vilket möter läkemedelsindustrins behov för att testa reagenser.